遠場熒光顯微技術普遍應用于生命科學研究領域。標準的遠場熒光顯微技術的分辨率受衍射極限公式 d=/(2NA)所限制。其中，λ是入射光的波長，NA為物鏡的數(shù)值孔徑。 受激發(fā)射損耗（STED）顯微技術克服了衍射極限問題，該技術利用鈦寶石和固體半導體激光組合，將圖像分辨率提升到了大分子水平。這項嶄新的遠場熒光納米顯微技術，已經(jīng)應用于很多前沿科學研究中，特別是生命科學領域。在標準實驗條件下，一組強度足以激化熒光體的脈沖激光，通過物鏡聚焦到衍射極限的光影，與另一組STED光束重疊。 STED光束的中心為零能量，周圍是很陡的能量邊沿，其橫截面的形狀像中空的甜香餅。STED光束與激化光束同步或相差數(shù)皮秒到達同一焦平面；激化光束迅速“熄滅”被STED激化的分子；隨后，把STED光束波長微調(diào)到熒光體光譜的紅光邊沿，同時將脈沖頻寬調(diào)整在熒光體發(fā)光時段內(nèi)，即1～5ns，效果最為理想。 熒光染色分子發(fā)射的機率隨著STED的脈沖能量而降低；基于此現(xiàn)象，染色分子發(fā)射熒光的能力將受次衍射中心光環(huán)范圍的約束，規(guī)范了顯微鏡的有效“點擴散函數(shù)”（Point Spread Function，PSF）。觀察樣品衍射極限以外的范圍，可以通過激光掃描顯示樣品的全貌。 如果能量強度Is可以把50%熒光體強度降低，它的半高全寬（FWHM）在焦平面的有效“點擴散函數(shù)”PSF大約為r ≈ λ/(2NA1+I/Is)，典型的有機染劑強度Is值大約為10～30MW/cm2。 松散的三重態(tài)（Triplet-state Relaxation，簡稱T-Rex）或松散的黑暗態(tài)（Dark-state Relaxation，簡稱D-Rex）STED顯微技術是高效的改良型STED顯微技術，也是目前為止能提供最高分辨率的顯微技術。其原理是降低或消除光漂白現(xiàn)象，其中重點是避免產(chǎn)生三重態(tài)。實際上，就是確保兩個連續(xù)脈沖波的時段大于熒光體所激化的超穩(wěn)定黑暗態(tài)的平均存在時間。由于這種黑暗態(tài)存在的平均時間在微秒量級，只要脈沖的重復頻率小于1MHz，就可以確保這種黑暗態(tài)在隨后的兩個連續(xù)脈沖到達前松散。光漂白是產(chǎn)生黑暗態(tài)的主要因素，松散的三重態(tài)能減低熒光染劑的光漂白的形成；從計量的角度看，就是促使I/Is有更大比值、而使r值更? ? 建立一個松散的三重態(tài)和波長可調(diào)的激化耗損的激光設定，一般通過鎖模的鈦寶石激光光源，從震蕩器泵浦一個可再生的放大器，再輸入一個光纖參量放大器（OPA）來提供所需的可見光波長。整套設備成本通常超過50萬美元。另外，這套設備所提供的脈沖在200～300fs之間，而STED顯微技術需要寬度在0.1～2ns之間的脈沖。要縮小脈沖頻寬差距，需要安裝光柵和其他光學元件，隨之也會增加系統(tǒng)復雜性，并會涉及到經(jīng)常性的檢查和系統(tǒng)維護，這也使STED顯微技術變成了“貴族化”技術。 2006年德國馬克斯·普朗克協(xié)會（Max Planck Institute）使用高能量超連續(xù)激光器提供激化和STED光源，為開發(fā)高效、經(jīng)濟實用的STED顯微技術打開了大門。一臺高能量超連續(xù)激光器，價格只是鈦寶石固體激光器的1/5，它可以直接實現(xiàn)T-Rex STED顯微技術，將圖像分辨率有效提高到30～50nm水平。高能量超連續(xù)激光光源，在大約20nm的帶寬范圍內(nèi)，能量強度大于20nJ，STED光束中心焦點縮小到10-9cm2以內(nèi)，中心焦點范圍的能量強度I也達到數(shù)個GW/cm2。 實驗設計 圖1顯示了STED顯微鏡的設計圖。Fianium公司提供的SC450-PP-HE超連續(xù)激光光源，其光束的帶寬、脈沖、儀器反應函數(shù)（IRF）等參數(shù)均符合STED顯微技術的要求。激化和STED光束來源于同一共振器，所以基本同步，無需調(diào)整。除了激光光源和共軛焦顯微鏡所需的光學元件外，STED納米顯微鏡的設計只需添加一些在市場上可以購買到的光學元件，就完全可以運作了。 圖1：STED納米顯微鏡的設計。使用帶寬可調(diào)的超連續(xù)單一光源，將STED顯微技術中所需的激化和損耗光束最佳化。實驗討論 圖2是通過圖1的設計，只使用一般的有機染劑所擷取的圖像。圖片顯示，使用共軛焦顯微技術的圖像不大清晰，而STED顯微技術則把哺乳類細胞的微管狀組織和稠密的納米粒子的圖像分辨率提升到30～50nm水平，超過光學衍射極限8～9倍。實驗結果證明，T-Rex STED顯微技術（或稱為“遠場熒光納米顯微技術”）可以通過一臺超連續(xù)激光器來實現(xiàn)，其獲得的圖像分辨率足以滿足諸多科研領域的應用需求。目前的設計，只將超連續(xù)光源的一半能量用于了STED光源，將來可以考慮引用余下的能量作為Z軸的激化光源，或者用作設計另外色譜的頻道。預期超連續(xù)光源的應用將拓展到發(fā)射藍光和綠光的染劑，這意味著大部分熒光染劑，都可以應用于T-Rex STED顯微技術。 圖2：用共軛焦顯微技術和STED顯微技術所獲得的圖像對比。實驗樣品為管狀細胞組織 （免疫標記）。為了滿足科研市場對顯微技術的需求，超連續(xù)激光光源的各種參數(shù)將不斷優(yōu)化，以配合不同的熒光染劑和光學元件的使用，從而使STED顯微技術能切實地普及到各個科研領域。 參考文獻： 1. STED microscopy with supercontinuum laser source, Dominik Wildanger, Eva Rittweger, Lars Kastrup and Stefan W. Hell, 23 June 2008/Vol.16, No. 13/OPTICS EXPRESS 9614. 2. STED application notes, Fianium Ltd., www.fianium.com.